RNAConnect与UltraMarathonRT：让复杂RNA的完整信息被读出来

前言

美国生物科技公司 RNAConnect 及其核心产品 UltraMarathonRT（uMRT） 系列bob星空体育，现已由 星空安卓下载安装 作为其特约代理经销商面向国内科研用户提供服务。该系列产品围绕新一代逆转录酶展开，面向RNA研究中的建库、定量与结构分析等应用场景。

一、关于RNAConnect

RNAConnect是一家专注于RNA分析工具研发的生命科学工具公司，其技术路线建立在II型内含子编码的逆转录酶之上。公司开发的UltraMarathonRT（uMRT）为高度优化的II型内含子逆转录酶，用于RNA到cDNA的逆转录环节，可处理长链、结构复杂及低丰度的RNA模板。

uMRT的设计目标，是改善传统逆转录酶在实际样本中的几类常见问题：对长转录本的覆盖不足、遇到二级结构时的提前脱落，以及在低起始量样本中的扩增表现。其应用范围覆盖基础研究、基因表达与调控、细胞与基因治疗、疫苗质控程序，以及肿瘤、罕见病、感染性疾病等方向的分析工作。

二、技术原理

传统逆转录酶（如MMLV、AMV来源）多为" distributive "型——在同一RNA模板上多次结合与脱离，遇到二级结构、重复序列或高GC区域时容易提前终止，产生截短、不完整或不准确的cDNA。

uMRT则表现出强持续性（processivity）：单个酶分子可在一次结合内沿RNA模板持续延伸，完成全长cDNA合成，对长达30 kb的病毒基因组亦能在单次延伸中覆盖。其分子结构中具有与持续性相关的结构元件，可在延伸路径上对模板结构进行解旋，无需依靠升温来打开RNA二级结构。

由此带来的工作温度区间为20–40°C（模板切换流程中部分环节为42°C），有助于保持RNA样本的完整性，避免高温条件下RNA的降解。

针对低起始量样本，配套的反应缓冲增强剂（BOOST buffer）可在RNA投入量大于1 pg的条件下改善cDNA合成表现，与MMLV、AMV来源的逆转录酶相比，对微量样本的处理能力有所提升。

三、热门产品介绍

① uMRT Template Switching Kit（模板切换bob星空体育）

货号：R1004S（20 rxns）｜R1004M（50 rxns）｜R1004L（100 rxns）

品名：UltraMarathonRT™ Template Switching Kit

产品特点：

• 具有稳定且有效的末端转移酶活性，可在cDNA的3'端非模板添加三个腺苷酸（AAA），实现模板切换；

• 与uMRT-TSO（模板切换寡核苷酸）配合，可在全长cDNA两端加上适配序列，直接用于PCR扩增与建库；

• 适用于长读长测序、SMART-seq、RACE等需要全长cDNA的工作流程；

• 对RNA投入量的要求较低，推荐范围为总RNA 1 ng–20 ng，或poly(A)-RNA 0.1 ng–20 ng。

存储条件：UltraMarathonRT酶短期（少于3个月）可存于-20°C，长期建议-80°C；其余组分可稳定保存于-20°C。该酶可耐受10次冻融而不出现明显活性下降，经过20次冻融后仍保持原始活性的90%。

工作原理：逆转录延伸至RNA 5'端后，酶继续在非模板链上添加AAA，此时TSO作为新模板被切换结合，uMRT沿TSO继续延伸，从而在全长cDNA末端引入已知序列，便于后续扩增与测序接头连接。

使用方法（简要流程）：

1. 将uMRT-dT18引物与RNA模板在95°C、30秒后冰上骤冷，完成引物退火；

2. 配制含2x RT Buffer、UltraMarathonRT酶、Low Boost、无核酸酶水的反应体系，加至退火产物中，42°C反应45分钟，随后4°C保存。

bob星空体育组分：UltraMarathonRT、2x RT Buffer、5x Template Switching Buffer、uMRT-TSO、Low Boost、无核酸酶水。

需自备试剂：10 mM dNTP mix、10 mM dATP、uMRT dT18引物、全长cDNA预扩增用引物、AmpPCR引物，以及推荐的KAPA HiFi DNA Polymerase（Roche，Cat# KK2102）。

② uMRT Two-Step RT-PCR Kit（两步法RT-PCRbob星空体育）

货号：R1005S（20 rxns）｜R1005M（50 rxns）｜R1005L（250 rxns）

品名：UltraMarathonRT® Two-Step RT-PCR Kit

产品特点：

• 适用于RNA长度、结构或GC含量各异的模板，兼顾灵敏度与产物保真度；

• 对RNA投入量的需求低至0.1 pg，对于大于10 kb的靶标，推荐投入量为1 pg；

• 配套的DNA聚合酶具强持续性与保真性，可扩增由uMRT生成的、长度达30 kb的cDNA产物。

存储条件：UltraMarathonRT酶短期（少于3个月）可存于-20°C，长期建议-80°C；其余组分可稳定保存于-20°C。该酶可耐受10次冻融而不出现明显活性下降，经过20次冻融后仍保持原始活性的90%。

工作原理：先由uMRT完成RNA到全长cDNA的逆转录——其内在解旋活性在无需升温的条件下主动打开RNA二级与三级结构，再由配套的强持续性、高保真DNA聚合酶对cDNA进行扩增。

使用方法（简要流程）：

1. 按投入量称取RNA模板，推荐范围为总RNA 0.1 pg–2 μg，或mRNA 0.1 pg–500 ng；对大于10 kb的靶标建议至少1 pg；

2. 以随机引物（15mer）或Oligo(dT)18为引物，30°C、15分钟完成逆转录，大于12 kb的模板建议30°C反应20–60分钟；

3. 95°C、1分钟灭活逆转录酶；

4. 取不高于PCR反应体积10%的未纯化cDNA产物进入后续PCR扩增。

bob星空体育组分：UltraMarathonRT、2x RT Buffer、High Boost、无核酸酶水、10 mM each dNTP mix、2x PCR master Mix、10 μM随机引物（15mer）、5 μM Oligo(dT)18 Primer。

主要应用方向：基因表达分析、全长异构体分析、全长病毒基因组分析、分子克隆，以及低投入量下的长链或结构化RNA分析。

③ uMRT Direct RNA-Seq Kit（直接RNA测序bob星空体育）

货号：R1008S（6 rxns）｜R1008M（48 rxns）

品名：UltraMarathonRT® Direct RNA-Seq Kit

产品特点：

• 与Oxford Nanopore Technologies的SQK-RNA004工作流程配套，用于ONT直接RNA测序的文库制备；

• 以低温度（30°C）的逆转录稳定步骤配合强持续性酶活，保持RNA完整性、扩大长转录本的代表性，并保留内源RNA修饰信号；

• 可直接读取RNA链，实现链特异性、异构体分辨的定量测量，同时保留碱基修饰信息；

• 与ONT流程衔接，下游连接、上样与碱基识别环节无需调整。

存储条件：UltraMarathonRT酶短期（少于6个月）可存于-20°C，长期建议-80°C；其余组分可稳定保存于-20°C。该酶可耐受10次冻融而不出现明显活性下降，经过20次冻融后仍保持原始活性的90%。

工作原理：直接RNA测序在测序前需要一次逆转录步骤，用于抚平RNA二级结构并稳定RNA分子，之后RNA链被直接拉过纳米孔读取。uMRT在30°C下完成该稳定步骤，以强持续性减少提前终止与读长截断，从而保留长RNA与内源修饰信号。

使用方法（简要流程）：

1. 准备RNA模板，推荐范围为总RNA 500 ng–1 μg，或poly(A)+ RNA 300 ng；

2. 按bob星空体育组分配制逆转录反应体系，30°C完成RT稳定步骤；

3. 按ONT SQK-RNA004流程完成后续连接与上样。

bob星空体育组分：UltraMarathonRT®（20 U/μL）、2x RT Reaction Buffer、10 mM each dNTP Mix、RNA Conditioner、5x Ligation Buffer、Q DNA Ligase（2,000,000 U/mL）、RNase Inhibitor（40 U/μL）、Quenching Buffer、无核酸酶水。

需自备试剂：ONT SQK-RNA004或SQK-RNA004-XL Direct RNA Sequencing Kit、ONT MinION®/GridION® RNA Flow Cell（FLO-MIN004RA）或PromethION® RNA Flow Cell（FLO-PRO004RA）、RNA Purification Beads、Qubit dsDNA HS Assay Kit（ThermoFisher，Q32851）。

主要应用方向：RNA修饰图谱绘制、异构体与UTR谱分析、病毒与宿主病原体转录组学、长链非编码RNA及重复序列或高GC区域的研究。

四、能解决哪些实验问题

1. 长转录本的覆盖不足

传统逆转录酶单次延伸能力有限，面对10 kb以上RNA时常产生截短产物。uMRT可在一次结合内覆盖长达30 kb的转录本，使全长cDNA的比例提升。

2. 二级结构导致的提前脱落

RNA的茎环、假结等结构会令普通逆转录酶中途停止。uMRT的解旋活性可在不升温的条件下处理这些结构，减少因模板折叠造成的漏检。

3. 低起始量样本的建库

配套BOOST buffer后，在RNA投入量大于1 pg的条件下即可完成cDNA合成，适合单细胞、微量组织与珍贵样本。

4. RNA-seq中的文库偏差

模板切换流程中，uMRT的稳定性末端转移酶活性有助于减少全长cDNA合成与文库构建中的偏差，使不同长度与丰度的转录本得到更均衡的代表。

5. RNA修饰与结构分析

uMRT对DMS、SHAPE类试剂（NAI、2A3）引入的修饰敏感，可用于DMS-MaP、SHAPE-MaP等结构分析，并在单分子水平提供分辨率，用于RNA二级结构、修饰位点与动态构象的研究。

6. RT-qPCR中的引物位置依赖问题

传统RT-qPCR中，引物位于GC富集区或结构化区域时常出现Ct值差异。uMRT生成全长cDNA后，下游引物可在转录本上更灵活地选择位置，Ct值的重复性有所改善。

五、常见问题解答

Q1：uMRT与传统MMLV、AMV逆转录酶的主要差异是什么？

A：传统逆转录酶为distributive型，在RNA上多次结合脱离，遇到结构或高GC区域易终止；uMRT为强持续性II型内含子逆转录酶，单次结合即可完成全长cDNA合成，并具解旋活性，可在20–40°C的较低温度下工作。

Q2：30°C反应会不会影响逆转录效率？

A：uMRT在该温度区间内表现稳定，延长反应时间（如大于12 kb模板建议20–60分钟）可补足延伸进度。较低温度同时有利于RNA样本的完整性。

Q3：酶反复冻融后活性如何？

A：UltraMarathonRT可耐受10次冻融而不出现明显活性下降，20次冻融后仍保持原始活性的90%。建议分装后使用。

Q4：R1004模板切换bob星空体育为何需要自备KAPA HiFi DNA Polymerase？

A：该bob星空体育聚焦逆转录与模板切换环节，全长cDNA的预扩增需另配高保真DNA聚合酶，Roche KAPA HiFi（Cat# KK2102）为推荐配套。

Q5：R1008直接RNA测序bob星空体育的"直接"是什么意思？

A：指RNA链不经逆转录为cDNA后测序，而是直接通过ONT纳米孔读取，因此可保留链特异性信息与内源RNA修饰信号；bob星空体育中的RT步骤用于结构稳定而非将RNA转为cDNA。

Q6：能否用于临床诊断或人体治疗？

A：上述产品均标注"For Research Use Only"，仅限研究用途，不用于临床诊断或人体应用。

Q7：不同bob星空体育的RNA投入量要求是否一致？

A：不一致。R1004推荐总RNA 1 ng–20 ng；R1005推荐总RNA 0.1 pg–2 μg，其中大于10 kb靶标建议1 pg；R1008推荐总RNA 500 ng–1 μg或poly(A)+ RNA 300 ng。具体以对应批次说明书为准。

Q8：uMRT是否兼容探针法qPCR？

A：可兼容染料法与探针法qPCR系统，下游qPCR检测环节可根据实验设计选择。

Q9：遇到复杂二级结构的RNA时如何优化？

A：可适当延长30°C反应时间，或对大于12 kb的模板将反应时间延长至20–60分钟；也可在投入量较低时使用High Boost改善表现。

Q10：bob星空体育内各组分是否都需要-80°C保存？

A：UltraMarathonRT酶短期（3个月或6个月，依产品而异）可放-20°C，长期建议-80°C；其余组分可稳定存于-20°C。请以各产品说明书中的具体要求为准。

关键词：RNAConnect、UltraMarathonRT、uMRT逆转录酶、II型内含子逆转录酶、强持续性逆转录酶、全长cDNA合成、RNA结构解旋活性、常温逆转录反应、模板切换建库、SMART-seq全长cDNA、R1004S模板切换bob星空体育、R1005S两步法RT-PCR、R1008S直接RNA测序bob星空体育、ONT SQK-RNA004文库制备、长读长RNA测序、低起始量RNA建库、RNA修饰检测DMS-MaP、SHAPE-MaP结构分析、30 kb病毒基因组全长逆转录

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（注：本文内容基于品牌公开资料及行业常规信息整理，具体以品牌信息文档为准。）

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